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[미생물학 test(실험) ] 세포로부터의 DNA 분리, 정제

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작성일 23-04-03 18:45

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세균 세포를 파괴시키는 방법에는 2가지가 있다. 그러나 파지 캡시드(단백질)를 제거하기 위해선 특수한 방법이 필요하다.

3.1.2 세포 추출물의 분리

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미생물학 실험,세포로부터의 DNA 분리, 정제

제 2 타입은 순수한 플라스미드 DNA이며 분리방법은 기본적으로 total cell DNA분리와 같지만 어느 단계에서는 염색체 DNA와 분리되어야 한다.

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cf> A600=1 → 0.8 × 109 cells/㎖

세포 추출물을 얻고자 할 때 몇 가지 장벽이 있다. 예외적으로 대장균(E. coli) 세포로부터 M13의 dsRF를 분리할 때는 플라스미드 분리 때와 같은 방법이 사용된다된다.
37℃, LB 배지, 150~250 rpm shaking incubator에서 E. coli의 generation time(doubling time)은 20분이고 최대 밀도(maximum density)인 약 2~3×109 cells/㎖에 도달할 때까지 분열한다.

제 3 타입은 파지 DNA이 며 파지 클로닝 벡터로 이용될 때 필요. 파지 DNA는 감염세포로부터 보다는 파지 자체에서 분리되는 것이 일반적이기 때문에 세균 DNA에 의해 오염되는 문제는 없다. 제 3 타입은 파지 DNA이 며 파지 클로닝 벡터로 이용될 때 필요. 파지 DNA는 감염세포로부터 보다는 파지 자체에서 분리되는 것이 일반적이기 때문에 세균 DNA에 의해 오염되는 문제는 없다. 예외적으로 대장균(E. coli) 세포로부터 M13의 dsRF를 분리할 때는 플라스미드 분리 때와 같은 방법이 사용된다. 배양물의 증식 정도는 OD값 측정(measurement)(600nm)으로 알 수 있다.

수확은 late log phase 때 수행하는 것이 권장되고 있고,
3.1.1 세균 배양물의 증식 및 수확
유전 Engineering을 위한 DNA분리는 3가지 유형으로 구분할 수 있다

순서
적 당히 증식된 세포를 원심분리 튜브(centrifuge tube)로 옮기고 원심분리 시킨 후, 상층액을 버리고 펠릿(pellet)을 작은 부피로 재현탁시킨다(배양액 1000㎖을 원심분리시킨 경우 pellet에 10㎖ 또는 그 이하의 배지를 붓고 재현탁시킴).
설명
Defined medium : 배지의 모든 구성成分이 알려져 있는 배지로 정밀하게 통제되는 조건에서 세균 배양물을 증식시켜야 할 때 사용.

형질 전환시에는 early log phase 때 즉 A600=0.4일 때의 배양물을 사용한다. 그러나 파지 캡시드(단백질)를 제거하기 위해선 특수한 방법이 필요하다.
3) 그람 음성 세균인 경우 outer membrane

제 1 타입은 세포 전체 DNA(total cell DNA)이며 클로닝될 유전자를 얻기 위해 필요.
2) 세포벽
1) 세포막
물리적 방법 : 기계적인 힘으로 파괴하는 방법.
Undefined medium : 배지의 구성成分에 대한 자세한 成分명과 함량이 알려져 있지 않은 배지로 단순히 DNA분리를 위한 경우에 적절.
다.

유전 공학을 위한 DNA분리는 3가지 유형으로 구분할 수 있다. 제 1 타입은 세포 전체 DNA(total cell DNA)이며 클로닝될 유전자를 얻기 위해 필요. 제 2 타입은 순수한 플라스미드 DNA이며 분리방법은 기본적으로 total cell DNA분리와 같지만 어느 단계에서는 염색체 DNA와 분리되어야 한다.

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